沉淀蛋白質的方法主要有:鹽析、有機溶劑、生物堿試劑、重金屬鹽、加熱凝固。
分析如下:
(1)鹽析破壞蛋白質的水化膜和電荷,采用不同濃度鹽可將不同的蛋白質分段析出,鹽析的蛋白質不變性,鹽析作用是可逆的。(2)有機溶劑可破壞蛋白質的水化膜,若調節(jié)pH=pI,則更易沉淀。低溫操作,快速分離溶劑不會使蛋白質變性,而常溫操作,蛋白質易變性。(3)沉淀生物堿試劑:鎢酸、三氯乙酸等的酸根與帶正電荷的蛋白質結合沉淀,會使蛋白質變性。(4)重金屬離子可與帶負電荷的蛋白質結合沉淀,會使蛋白質變性。(5)在等電點加熱蛋白質可形成凝塊沉淀,會使蛋白質變性。
前已有很多去蛋白方法可供使用,但使用各種方法之前應了解該方法是否會導致生物樣品中的藥物發(fā)生分解或影響藥物的提取等。
通常除蛋白的方法是在含蛋白樣品中加入適當?shù)某恋韯┗蜃冃詣?,而有機溶劑和酸類沉淀的蛋白是不可逆的。也可用透析法與超濾法除去樣品中蛋白。
當然還可以熱沉淀,使蛋白質脫水而沉淀(如有機溶劑、中性鹽),有的是由于蛋白質形成不溶性鹽而析出(如高氯酸),離心后取上清液用于分析。甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有機溶劑,中性鹽可用氯化銨等。無機鹽沉淀蛋白是可逆的,即將蛋白稀釋后仍具有生理活性
一般最常見的是鹽析沉淀,就是在蛋白質溶液中加入一定量的硫酸銨,蛋白質便會沉淀下來,不同蛋白沉淀所需要的硫酸銨濃度不一樣,通過這個方法也可以對蛋白進行初步的純化分離。
再有就是等電沉淀,通過調節(jié)蛋白溶液的pH,使其剛好達到目標蛋白的等電點,這時候蛋白分子將不帶有電荷,在相互碰撞聚集過程中沉淀下來。與之類似的有通過加沉淀劑或絮凝劑比如明礬之類的,也可以沉淀蛋白。
另外還有就是親和沉淀,利用生物分子親和力,比如抗原抗體親和、酶與底物親和等性質,將配對的另一半固定在某些介質,比如小磁珠上,就能將溶液里面的目的蛋白抓住沉淀下來。
蛋白質沉淀 蛋白質在溶液中的穩(wěn)定性是有條件的、相對的.如果條件發(fā)生改變,破壞了蛋白質溶液的穩(wěn)定性,蛋白質分子則聚集成大的顆粒沉淀出來.
蛋白質溶液的穩(wěn)定性與質點大小、電荷和水化作用有關,只要破壞這些條件,蛋白質自然會從溶液中沉淀出.
沉淀蛋白質有以下方法:
1、鹽析法
2、有機溶劑沉淀法
3、重金屬鹽沉淀法
4、生物堿試劑和某些酸(三氯醋酸,磺基水楊酸,硝酸等)沉淀法
5、加熱變性沉淀法
蛋白質變性:蛋白質的天然構象遭到破壞導致其生物活性喪失的現(xiàn)象.蛋白質在受到光照、熱、有機溶劑以及一些變性劑的作用時,次級鍵受到破壞,導致天然構象的破壞,使蛋白質的生物活性喪失.
蛋白質分子凝聚從溶液中析出的現(xiàn)象稱為蛋白質沉淀(precipitation),變性蛋白質一般易于沉淀,但也可不變性而使蛋白質沉淀,在一定條件下,變性的蛋白質也可不發(fā)生沉淀.
蛋白質所形成的親水膠體顆粒具有兩種穩(wěn)定因素,即顆粒表面的水化層和電荷.若無外加條件,不致互相凝集.然而除掉這兩個穩(wěn)定因素(如調節(jié)溶液pH至等電點和加入脫水劑)蛋白質便容易凝集析出.
可以看出,如將蛋白質溶液pH調節(jié)到等電點,蛋白質分子呈等電狀態(tài),雖然分子間同性電荷相互排斥作用消失了.但是還有水化膜起保護作用,一般不致于發(fā)生凝聚作用,如果這時再加入某種脫水劑,除去蛋白質分子的水化膜,則蛋白質分子就會互相凝聚而析出沉淀;反之,若先使蛋白質脫水,然后再調節(jié)pH到等電點,也同樣可使蛋白質沉淀析出.

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