電泳實(shí)驗(yàn)應(yīng)該(聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中,應(yīng)注意哪些事項(xiàng)?)
1.聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中,應(yīng)注意哪些事項(xiàng)?
一、凝膠制備時(shí)：TEMED和AP要后加，加入后用玻棒緩慢勻速的混勻，避免有氣泡產(chǎn)生；然后馬上注入電泳槽內(nèi)，插入梳子，這時(shí)也要?jiǎng)蛩伲荒芴?，因?yàn)樘脑?huà)底部的膠會(huì)比上面的膠凝的快，影響膠的質(zhì)量，同時(shí)小心有氣泡；
二、加樣時(shí)要注意：1.每空的上樣量不能過(guò)大，以免樣品溢出，造成各泳道相互污染；
2.為了避免邊緣效應(yīng)，在未加樣的泳道加入等量的樣品緩沖液。注意事項(xiàng)
(1)由于與凝膠聚合有關(guān)的硅橡膠稱(chēng)、玻璃板表面不光滑潔凈，在電泳時(shí)會(huì)造成凝膠板與玻璃板或硅橡膠條剝離，產(chǎn)生氣泡或滑膠；剝膠時(shí)凝膠板易斷裂，為防止引現(xiàn)象，所用器材均應(yīng)嚴(yán)格地清洗。硅橡膠條的凹槽、樣品槽模板及電泳槽用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”仔細(xì)清洗。玻璃板浸泡在重鉻酸鉀洗液3~4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上，用清水洗凈，再用泡沫海綿蘸取“洗潔凈”反復(fù)刷洗，最后用蒸餾水沖洗，直接陰干或用乙醇沖洗后陰干。
(2)安裝電泳槽和鑲有長(zhǎng)、短玻璃板的硅橡膠框時(shí)，位置要端正，均勻用力旋緊固定螺絲，以免緩沖液滲漏。樣品槽板梳齒應(yīng)平整光滑。
(3)在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在分離膠鄉(xiāng)合后進(jìn)行。洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進(jìn)行預(yù)電泳，以充分利用濃縮膠的濃縮效應(yīng)。
(4)電泳時(shí)，電泳儀與電泳槽間正、負(fù)極不能接錯(cuò)，以免樣品反方向泳動(dòng)，電泳時(shí)應(yīng)選用合適的電流、電壓，過(guò)高或過(guò)低無(wú)可影響電泳效果。
(5)SDS純度：在SDS-PAGE中，需高純度的SDS，市售化學(xué)純SDS需重結(jié)晶一次或兩次方可使用。重結(jié)晶方法如下：稱(chēng)20g SDS放在圓底燒瓶中，加300ml無(wú)水乙醇及約半牛角匙活性碳，在燒瓶上接一冷凝管，在水浴中加熱至乙醇微沸，回流約10min，用熱布氏漏斗趁熱過(guò)濾。濾液應(yīng)透明，冷卻至室溫后，移至-20℃冰箱中過(guò)夜。次日用預(yù)冷的布氏漏斗抽濾，再用少量-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇洗滌白色沉淀3次，盡量抽干，將白色結(jié)晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。
(6)用SDS處理蛋白質(zhì)樣品時(shí)，每次都會(huì)在沸水溶中保溫3~5min，以免有亞穩(wěn)聚合物存在。
(7)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率最好在0.2~0.8之間均勻分布。值得指出的是，每次測(cè)定未知物分子量時(shí)，都應(yīng)同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，而不是利用過(guò)去的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。用此法測(cè)定的分子量只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整的分子量。為測(cè)得精確的分子量范圍，最好用其他測(cè)定蛋白分子量的方法加以校正。此法對(duì)球蛋白及纖維狀蛋白的分子量測(cè)定較好，對(duì)糖蛋白，膠原蛋白等分子量測(cè)定差異較大。
(8)對(duì)樣品的要求：應(yīng)采納低離子強(qiáng)度的樣品。如樣品中離子強(qiáng)度高，則應(yīng)透析或經(jīng)離子交換除鹽。加樣時(shí)，應(yīng)保持凹形加樣槽膠面平直。加樣量以10~15μl為宜，如樣品系較稀的液體狀，為保證區(qū)帶清晰，加樣量可增加，同時(shí)應(yīng)將樣品溶解液濃度提高二倍或更高。
(9)由于凝膠中含SDS，直接制備干板會(huì)產(chǎn)生龜裂現(xiàn)象。如需制干板，則用25%異丙醇內(nèi)含7%乙酸浸泡，并經(jīng)常換液，直到SDS脫盡（約需2~3天），才可制備干板。為方便起見(jiàn)，常采用照像法，保存照片。
2.核酸凝膠電泳實(shí)驗(yàn)需要注意什么
1、加樣時(shí)槍頭不要碰壞孔壁，否則DNA帶型不整齊。大多情況下，加樣時(shí)不必更換槍頭，可在陰極槽中反復(fù)吸打電泳緩沖液清洗，但對(duì)Southern 印跡轉(zhuǎn)移和需回收DNA時(shí)，應(yīng)每個(gè)樣品使用新的槍頭，以避免樣品交叉污染。
2、上樣緩沖液不僅提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣孔底，還使樣品帶色，便于上樣，估計(jì)電泳時(shí)間和判斷電泳位置。
3、EB是一種強(qiáng)烈誘變劑并有中度毒性，應(yīng)戴手套操作，對(duì)于含有EB的溶液也不應(yīng)直接倒下水道，用后妥善凈化處理：EB含量大于0.5μg/ml溶 液先用水將EB濃度稀釋至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不時(shí)輕輕搖蕩混勻，室溫放置1小時(shí)，濾紙過(guò)濾將活性碳與濾紙密封在塑料袋中作為有害廢物丟棄?；蛴脤?zhuān)用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附過(guò)夜，再焚燒袋子即 可。
4、應(yīng)在暗箱窗口觀(guān)察結(jié)果，避免紫外線(xiàn)操作者的損傷。
5、電泳過(guò)程中，EB向陰極移動(dòng)（與DNA相反），延長(zhǎng)電泳時(shí)間，EB會(huì)從凝膠中遷移出來(lái)，從而使小片段DNA難于檢測(cè)，可將凝膠浸在 0.5μg/ml EB溶液中重新染色后檢測(cè)。
6、加樣孔的加樣量依DNA樣品中片段的數(shù)量及大小而定，通常對(duì)0.5cm寬的加樣孔，DNA上樣量在0.1~0.5μg即可有良好的觀(guān)察效果。如 樣品為酶切產(chǎn)物（由大小不同的DNA片段組成），每孔加20~30μg DNA也不致明顯影響分辨率。
7、小的凝膠——微型凝膠和中型凝膠的電泳一般比大的凝膠要快，常常用于快速分析。當(dāng)選擇微型或中型凝膠裝置時(shí)要考慮凝膠槽盛裝緩沖液的體積，小膠 通常要在高壓下電泳（>10V/cm），所以選擇一個(gè)相對(duì)較大的緩沖液槽比較有利。
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3.核酸凝膠電泳實(shí)驗(yàn)需要注意什么
大多情況下，加樣時(shí)不必更換槍頭，可在陰極槽中反復(fù)吸打電泳緩沖液清洗，但對(duì)Southern 印跡轉(zhuǎn)移和需回收DNA時(shí)，應(yīng)每個(gè)樣品使用新的槍頭，以避免樣品交叉污染。
2、上樣緩沖液不僅提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣孔底，還使樣品帶色，便于上樣，估計(jì)電泳時(shí)間和判斷電泳位置。3、EB是一種強(qiáng)烈誘變劑并有中度毒性，應(yīng)戴手套操作，對(duì)于含有EB的溶液也不應(yīng)直接倒下水道，用后妥善凈化處理：EB含量大于0.5μg/ml溶 液先用水將EB濃度稀釋至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不時(shí)輕輕搖蕩混勻，室溫放置1小時(shí)，濾紙過(guò)濾將活性碳與濾紙密封在塑料袋中作為有害廢物丟棄。
或用專(zhuān)用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附過(guò)夜，再焚燒袋子即 可。4、應(yīng)在暗箱窗口觀(guān)察結(jié)果，避免紫外線(xiàn)操作者的損傷。
5、電泳過(guò)程中，EB向陰極移動(dòng)（與DNA相反），延長(zhǎng)電泳時(shí)間，EB會(huì)從凝膠中遷移出來(lái)，從而使小片段DNA難于檢測(cè)，可將凝膠浸在 0.5μg/ml EB溶液中重新染色后檢測(cè)。6、加樣孔的加樣量依DNA樣品中片段的數(shù)量及大小而定，通常對(duì)0.5cm寬的加樣孔，DNA上樣量在0.1~0.5μg即可有良好的觀(guān)察效果。
如 樣品為酶切產(chǎn)物（由大小不同的DNA片段組成），每孔加20~30μg DNA也不致明顯影響分辨率。7、小的凝膠——微型凝膠和中型凝膠的電泳一般比大的凝膠要快，常常用于快速分析。
當(dāng)選擇微型或中型凝膠裝置時(shí)要考慮凝膠槽盛裝緩沖液的體積，小膠 通常要在高壓下電泳（>10V/cm），所以選擇一個(gè)相對(duì)較大的緩沖液槽比較有利?！?/p>
4.瓊脂糖凝膠電泳測(cè)dna實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意哪些問(wèn)題
凝膠電泳操作注意事項(xiàng)： 1. 緩沖系統(tǒng)：在沒(méi)有離子存在時(shí)，電導(dǎo)率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。
長(zhǎng)時(shí)間高壓電泳時(shí)，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。 2. 瓊脂糖：不同廠(chǎng)家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。
3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。
瓊脂糖凝膠電泳注意事項(xiàng)及操作流程 凝膠電泳操作注意事項(xiàng)： 1. 緩沖系統(tǒng)：在沒(méi)有離子存在時(shí)，電導(dǎo)率最小，DNA不遷移，或遷移極慢，在高離子強(qiáng)度的緩沖液中，電導(dǎo)很高并產(chǎn)熱，可能導(dǎo)致DNA變性，因此應(yīng)注意緩沖液的使用是否正確。長(zhǎng)時(shí)間高壓電泳時(shí)，常更新緩沖液或在兩槽間進(jìn)行緩沖液的循環(huán)是可取的。
2. 瓊脂糖：不同廠(chǎng)家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。 3. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。
倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，影響電泳結(jié)果。 4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5ug的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定，過(guò)多的量會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。
5. 電泳系統(tǒng)的變化會(huì)影響DNA的遷移，加入DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物進(jìn)行判定是必要的。 6. DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA的遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。
7. DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來(lái)決定凝膠的濃度。
小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率。
5.核酸電泳的注意事項(xiàng)
1. 瓊脂糖：不同廠(chǎng)家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。
2. 凝膠的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)與電泳槽中的相一致，溶解的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入前凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié)果。
3. 電泳緩沖液：為保持電泳所需的離子強(qiáng)度和pH，應(yīng)常更新電泳緩沖液。4. 樣品加入量：一般情況下，0.5cm寬的梳子可加0.5μg的DNA量，加樣量的多少依據(jù)加樣孔的大小及DNA中片段的數(shù)量和大小而定。
當(dāng)加樣孔大時(shí)，樣品上樣量應(yīng)相應(yīng)加大，否則會(huì)造成條帶淺甚至辯認(rèn)不清；反之則應(yīng)適當(dāng)減少加樣量，但是上樣量過(guò)多會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。5. DNA樣品中鹽濃度會(huì)影響DNA的遷移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。
DNA遷移率取決于瓊脂糖凝膠的濃度，遷移分子的形狀及大小。采用不同濃度的凝膠有可能分辨范圍廣泛的DNA分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)DNA分子的范圍來(lái)決定凝膠的濃度。
小片段的DNA電泳應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳以提高分辨率?；厥章实突?yàn)榱?1. 漂洗緩沖液中沒(méi)加入乙醇.在使用前應(yīng)確保乙醇已加入漂洗液PW中。
2. 吸附材料上有乙醇?xì)埩?洗脫時(shí)硅膠膜或硅膠樹(shù)脂上有漂洗緩沖液殘留，因含乙醇會(huì)降低洗脫效率。在洗脫前可通過(guò)再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘，徹底去除漂洗緩沖液。
3. 洗脫緩沖液pH值偏低.DNA只在低鹽buffer中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水。洗脫效率取決于pH值。
最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其pH值在此范圍內(nèi)。
4. 洗脫液加入位置不正確.洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)完全覆蓋硅膠膜的表面，達(dá)到最大洗脫效率。DNA質(zhì)量不好 洗脫產(chǎn)物含有乙醇?xì)埩?洗脫時(shí)硅膠膜或硅膠樹(shù)脂上有漂洗緩沖液殘留，會(huì)使洗脫產(chǎn)物中含有乙醇，影響下游操作。
在洗脫前可通過(guò)再次離心或置于50℃烤箱中5-10分鐘，徹底去除漂洗緩沖液。
