植物遺傳轉(zhuǎn)化的(植物體雜交注意事項)

1.植物體雜交注意事項

植物體細胞雜交（plant somatic hybridization），又稱原生質(zhì)體融合（Protoplast fusion ）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導融合，然后進行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細胞具有細胞壁，未脫壁的兩個細胞是很難融合的，植物細胞只有在脫去細胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，所以植物的細胞融合也稱為原生質(zhì)體融合。

說道植物細胞融合，它和動物細胞融合還是有很大差別的。

第一，前者因為有細胞壁，對融合有負面影響，首先要除壁變成原生質(zhì)體，可以用纖維素酶和果膠酶除壁。

第二，后者除了要加必要的營養(yǎng)物質(zhì)外，還要加血清保持環(huán)境穩(wěn)定。

細胞融合方法主要有化學、生物和物理方法。一般學生實驗室使用PEG（主要含有聚乙二醇）法融合。其優(yōu)點是操作簡單不需要特殊的設備。只需在去壁的細胞加入適量的PEG處理適當?shù)臅r間，然后終止PEG的作用，然后在普通光學顯微鏡即可看到融合細胞。這種方法也有缺點，如不好控制PEG作用的時間，而且PEG對細胞也可能有害。

只有處理時間得當，細胞壁去除了才可能提高成活率。

優(yōu)點：植物體細胞雜交是兩種異源原生質(zhì)體，在誘導劑誘發(fā)下相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細胞，進一步發(fā)育成雜種植物體。通過細胞融合技術(shù)可以克服種、屬以上職務有性雜交不親和障礙，為廣泛重組遺傳物質(zhì)開辟了新途徑，也為攜帶外源遺傳物質(zhì)（信息）的大分子滲入細胞創(chuàng)造了條件，從而更進一步擴大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。

2.農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化過程中為什么必須要誘導植物regeneration

幾種常用的植物轉(zhuǎn)基因方法

遺傳轉(zhuǎn)化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)再生植株可分成兩大類，第一類據(jù)要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法、基因槍法；另一類不需要通過組織培養(yǎng)，目前比較成熟的主要有花粉管通道法。

1農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙于葉植物的受傷部位，并誘導產(chǎn)生冠瘓瘤或發(fā)狀根。根想農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。 農(nóng)桿菌介導法起初只被用于雙于葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。

2基因槍介導轉(zhuǎn)化法

利用火爆炸或高壓氣體加速（這一加速設備被稱為基因槍），將包裹了帶目的基因的

DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中，然后通過細腦和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，選出其中轉(zhuǎn)基因陽性植株即為轉(zhuǎn)基因植株。與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相比，基因槍法轉(zhuǎn)化的一個主要優(yōu)點是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質(zhì)粒的構(gòu)建也相對簡單，因此也是目前轉(zhuǎn)基因研究中應用較為廣泛的一種方法。

3花粉管通道法

在授粉后向于房含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個體。該方法于印年代初期由我國學者周光字提出，我國目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規(guī)育種工作者易于掌握。

3.植物染色體標本的制備的注意事項

植物染色體制片技術(shù)是植物細胞遺傳學、染色體工程、植物細胞生物學、植物細胞分類學和物種生物學等眾多學科的基本實驗技術(shù)。植物染色體的研究由于和植物遺傳育種工作的結(jié)合而獲得良好的發(fā)展。因此，植物染色體的技術(shù)在這些研究工作中具有特別重要的意義[1-3]。Belling(1921)提出染色體壓片技術(shù)后，植物壓片已成為植物染色體研究中廣泛應用的常規(guī)技術(shù)[1]。但是由于植物細胞有很堅實的細胞壁，染色體很難像動物染色體那樣平整地貼在載玻片上。陳瑞陽（1982）提出了植物染色體標本制備的酶解去壁低滲法。本文以韭蘭為材料，對植物染色體常規(guī)壓片，去壁低滲法制片技術(shù)、染色效果進行了比較，以期在不同的材料及條件下選擇適宜的染色體制片技術(shù)，從而獲得較好的效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗用植株由校園內(nèi)采集。

1.2 根尖制片

1.2.1 常規(guī)壓片 通常是在早上9-10點采集蔥蘭的根然后在室溫下放入0.1%秋水仙素溶液中進行預處理處理8 h。然后就在常溫把材料放在卡諾氏固定液下固定10m，接下來就在1 mol/L鹽酸溶液中解離到松軟剛合適為止。最后是用蒸餾水將蔥蘭根沖洗干凈，這樣前處理就結(jié)束。處理完后就可以用醋酸洋紅染色或改良苯酚品紅染色[4]。壓片/涂片后選取典型的染色體，在40倍物鏡及油鏡下顯微照相。

1.2.2 去壁低滲法 去壁低滲法也是把材料放0.1%秋水仙素溶液中進行預處理處理8 h。然后前低滲即是將根尖放在0.075 tool/L KCI低滲液中，在20~25℃條件下處理0.5h。接下來就是最關(guān)鍵的去壁，倒去KCI溶液，加入2.5%混合酶液，在25~30℃溫度下處理2~5 h左右。去壁后要進行后低滲，使細胞完全脹，即是用20~30℃蒸餾水慢慢沖洗2~3次后，再將根尖放在0.075 tool/L KCI低滲液中處理。

4.試述農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化中外植體培養(yǎng)主要有哪些階段

1.種子消毒

成熟的水稻（Rice）種子去殼后放入無菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，無菌水沖洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其間需經(jīng)常搖動，再用無菌水洗3-4次，用無菌濾紙吸干多余的水分，將種子接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上，每皿約30粒，于28℃暗培養(yǎng)。

2.繼代培養(yǎng)

經(jīng)過近1月的誘導，水稻（Rice）長出黃色膨大的愈傷組織，去其盾片，將愈傷轉(zhuǎn)至新鮮的愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上進行繼代。每2周繼代一次，一般繼代2-4次即可獲得適合轉(zhuǎn)基因的嫩黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織。在繼代培養(yǎng)2周后，挑選胚性顆粒用于遺傳轉(zhuǎn)化。

3.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

在轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落在1ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在50ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)基（含相應抗生素（antibiotic））中加入1ml上述培養(yǎng)物，200rpm,28℃培養(yǎng)5-6hr至OD600為0.6-1.0，培養(yǎng)結(jié)束前2hr加入乙酰丁香酮（AS，終濃度100uM）。取上述菌液在室溫下，4000rpm,10min，棄上清，加入MS液體培養(yǎng)基（含AS 100uM）重懸菌體，在與上相同的條件下培養(yǎng)2hr，使菌液的OD600=0.5左右，此時可用來轉(zhuǎn)化愈傷組織。

4.共培養(yǎng)

將水稻（Rice）胚性愈傷組織浸入農(nóng)桿菌菌液20-30min，再用無菌吸水紙吸干水分，將侵染的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM）上，28℃暗培養(yǎng)三天。

5.洗菌

共培養(yǎng)的愈傷組織先用無菌水沖洗3遍，再浸泡在含Cef 250 mg/L的MS液體培養(yǎng)基中20-30min后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入無菌濾紙上吸干。

6.選擇培養(yǎng)

將吸干水分的愈傷組織接種于選擇培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 250 mg/L）上。3周后，挑選新長出的愈傷接種于選擇培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L）上，再選擇3周。

5.分化培養(yǎng)

將經(jīng)過2次選擇得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入到預分化培養(yǎng)基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 5 g/L + 麥芽糖30g/L）上暗培養(yǎng)10天左右，再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 麥芽糖30 g/L）上光照培養(yǎng)。

7.生根培養(yǎng)

約1-2個月，將2cm左右高的幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基（1/2MS + NAA 0.5 mg/L + Hyg 15 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 蔗糖20g/L）上誘導不定根的發(fā)生。

8.轉(zhuǎn)基因苗的移栽

當幼苗長至10cm高時，將幼苗取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。