蛋白質(zhì)含量測(cè)定用什么方法方法(測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法,其原理各是什么)

1.測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些,其原理各是什么

Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 （一）實(shí)驗(yàn)原理 雙縮脲法（Biuret法）和Folin—酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡?白質(zhì)溶液測(cè)定的方法。

1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白 質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。

這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定 法。 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（?max），由465nm變?yōu)?95n m，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。

在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。 Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是： （1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1?g。

這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生 的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的 多。 （2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。

完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的 過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。

因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。 （3）干擾物質(zhì)少。

如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不 干擾此測(cè)定法。

2.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定都有哪幾種方法,適用情況以及優(yōu)缺點(diǎn)

①凱氏定氮法 原理：蛋白質(zhì)平均含氮量為16%。

當(dāng)樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉(zhuǎn)化為銨鹽，在強(qiáng)堿性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最后用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定硼酸，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酸的用量即可求出蛋白質(zhì)中的含氮量和蛋白質(zhì)含量。 ②雙縮脲法 原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在堿性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。

蛋白質(zhì)中的肽鍵實(shí)際上就是酰胺鍵，故多肽、蛋白質(zhì)等都有雙縮脲（biuret）反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色或紫色復(fù)合物。比色定蛋白質(zhì)含量。

缺點(diǎn)：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 （數(shù)mg），且會(huì)受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 準(zhǔn)確度 較高，不受蛋白質(zhì)的種類影響。

③Folin酚法（Lowry） Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑（堿性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。

在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+, Cu+能定量地與Folin-酚試劑反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)，600nm比色測(cè)定蛋白質(zhì)含量。 靈敏度較高（約 0.1 mg），但較麻煩，也會(huì)受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。

步驟中各項(xiàng)試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會(huì)有大誤差。 ④紫外法 280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進(jìn)行測(cè)定。

280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計(jì)算： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.24E280-0.74E260 (280 260為角標(biāo)) ⑤色素結(jié)合法（Bradford 法） 直接測(cè)定法：利用蛋白質(zhì)與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結(jié)合物的光吸收用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。 考馬斯亮蘭（CBG）染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

CBG 有點(diǎn)像指示劑，會(huì)在不同的酸堿度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍(lán)色。當(dāng) CBG接到蛋白質(zhì)上去的時(shí)候，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)會(huì)提供 CBG一個(gè)較為中性的環(huán)境，因此會(huì)變成藍(lán)色。

當(dāng)樣本中的蛋白質(zhì)越多，吸到蛋白質(zhì)上的CBG也多，藍(lán)色也會(huì)增強(qiáng)。因此，藍(lán)色的呈色強(qiáng)度，是與樣本中的蛋白質(zhì)量成正比。

間接測(cè)定法：蛋白質(zhì)與某些酸性或堿性色素分子結(jié)合形成不溶性的鹽沉淀。用分光光度計(jì)測(cè)定未結(jié)合的色素，以每克樣品結(jié)合色素的量來(lái)表示蛋白質(zhì)含量的多少。

⑥BCA法 BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4'-二羧-2,2'-二喹啉)法與Lowry法相似，主要差別在堿性溶液中，蛋白質(zhì)使Cu2+轉(zhuǎn)變Cu+后，進(jìn)一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結(jié)合產(chǎn)生深紫色，在波長(zhǎng)562 nm有強(qiáng)的吸收。 它的優(yōu)點(diǎn)在于堿性溶液中BCA 比Folin試劑穩(wěn)定，因此BCA與堿性銅離子溶液結(jié)合的呈色反應(yīng)只需一步驟即完成。

靈敏度Lowry法相似。 本方法對(duì)于陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會(huì)受還原糖 及EDTA的干擾。

⑦膠體金測(cè)定法 膠體金（colloidal gold）是氯金酸（chloroauric acid）的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，并能與多種生物大分子結(jié)合。 膠體金是一種帶負(fù)電荷的疏水膠體遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色，顏色的改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

⑧其他方法 有些蛋白質(zhì)含有特殊的 非蛋白質(zhì)基團(tuán)，如 過(guò)氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團(tuán)，可測(cè) 403 nm 波長(zhǎng)的吸光來(lái)定量之。 含特殊金屬的酶 （如鎘），則可追蹤該金屬。

3.蛋白質(zhì)定量測(cè)定的方法有哪些

定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。

凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費(fèi)時(shí)

8~10小時(shí) 將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定；干擾少；費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)

雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò)合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測(cè)定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似

紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；

Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；

各種硫醇 耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)；操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強(qiáng)堿性緩沖液；

SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化

4.蛋白質(zhì)含量測(cè)定的基本方法有哪些

pro的測(cè)定方法分為兩大類：一類是利用pro的共性，即含氮量，肽鏈和折射率測(cè)定pro含量，另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定pro含量。

但是食品種類很多，食品中pro含量又不同，特別是其他成分，如碳水化合物，脂肪和維生素的干擾成分很多，因此pro的測(cè)定通常利用經(jīng)典的剴氏定氮法是由樣品消化成銨鹽蒸餾，用標(biāo)準(zhǔn)酸液吸收，用標(biāo)準(zhǔn)酸或堿液滴定，由樣品中含氮量計(jì)算出pro的含量。由于食品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。

5.蛋白質(zhì)含量測(cè)定藥典規(guī)定必須用什么方法

使用凱氏定氮的方法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量。

凱氏定氮法 凱氏定氮法

蛋白質(zhì)測(cè)定的國(guó)標(biāo)規(guī)定方法——?jiǎng)P氏定氮法介紹

【GB/T 5009.5—1985】

食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法

本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定。

1 原理

蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

2 試劑

所有試劑均用不含氨的蒸餾水配制。

2.1 硫酸銅。

2.2 硫酸鉀。

2.3 硫酸。

2.4 2%硼酸溶液。

2.5 混合指示液：1份0.1%甲基紅乙醇溶液與5份0.1%溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。也可用2份0.1%甲基紅乙醇溶液與1份0.1%次甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合。

2.6 40%氫氧化鈉溶液。

2.7 0.05N硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或0.05N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 儀器

定氮蒸餾裝置：如圖所示。

（圖略）

4 操作方法

4.1 樣品處理：精密稱取0.2~2.0g固體樣品或2~5g半固體樣品或吸取10~20ml液體樣品（約相當(dāng)?shù)?0~40mg），移入干燥的 100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20ml硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。小心加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶?jī)?nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h。取下放冷，小心加20ml 水。放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白試驗(yàn)。

4.2 按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水至約2/3處，加甲基紅指示液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)的水。

4.3 向接收瓶?jī)?nèi)加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化稀釋液由小玻杯流入反應(yīng)室，并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應(yīng)室內(nèi)，塞緊小玻杯的棒狀玻塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并加水于小玻杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開(kāi)始蒸餾。蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過(guò)冷凝管而進(jìn)入接收瓶?jī)?nèi)，蒸餾5min。移動(dòng)接受瓶，使冷凝管下端離開(kāi)液面，再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)。

同時(shí)吸取10.0ml試劑空白消化液按4.3操作。

4.4 計(jì)算

式中：X——樣品中蛋白質(zhì)的含量，%；

V1——樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml;

V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml;

N——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；

0.014——1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)；

m——樣品的質(zhì)量（體積），g(ml);

F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。蛋白質(zhì)中的氮含量一般為15~17.6%，按16%計(jì)算乘以6.25即為蛋白質(zhì)，乳制品為6.38，面粉為5.70，玉米、高粱為6.24，花生為5.46，米為5.95，大豆及其制品為5.71，肉與肉制品為6.25，大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83，芝麻、向日葵為 5.30。

附加說(shuō)明：

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會(huì)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分委員會(huì)提出，由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)起草。

6.利用蛋白質(zhì)的成色反應(yīng)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量的方法有哪些

通常有三種方法：

(1)茚三酮反應(yīng)（ninhydrin reaction）

蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的氨基酸可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)外，所有的α氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。α氨基酸與茚三酮在弱酸性溶液中共熱，反應(yīng)后經(jīng)失水脫羧生成氨基茚三酮，再與水合茚三酮反應(yīng)生成紫紅色，最終為藍(lán)色物質(zhì)。脯氨酸等仲胺氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)。該反應(yīng)可廣泛用于各種氨基酸的定性或定量測(cè)定。

(2)雙縮脲反應(yīng)（biuret reaction）

蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。該反應(yīng)是肽鍵常用的反應(yīng)，即在堿性銅溶液中，肽鍵與銅離子形成絡(luò)合物，呈紫色（在540nm有最大光吸收峰）。

(3)考馬斯亮藍(lán)法：

即蛋白質(zhì)與一種蛋白質(zhì)染料考馬斯亮藍(lán)G250反應(yīng)形成復(fù)合物，該復(fù)合物在595nm有最大光吸收峰。

注意：蛋白質(zhì)遇硝酸也顯色為黃色，不過(guò)這樣蛋白質(zhì)就變性了。