蛋白質(zhì)分離層析方法(蛋白質(zhì)分離純化的四種方法)

1.蛋白質(zhì)分離純化的四種方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出。

2、有機(jī)溶劑沉淀法：

有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。

3、蛋白質(zhì)沉淀劑：

蛋白質(zhì)沉淀劑僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉淀作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。

擴(kuò)展資料：

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動的主要承擔(dān)者。沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。

機(jī)體中的每一個細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。蛋白質(zhì)占人體重量的16%~20% ，即一個60kg重的成年人其體內(nèi)約有蛋白質(zhì)9.6~12kg。

人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類很多，性質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，并在體內(nèi)不斷進(jìn)行代謝與更新。

參考資料來源：百度百科-蛋白質(zhì)分離純化

2.常用的蛋白質(zhì)分離純化方法有哪幾種

其中凝膠層析可用于測定蛋白質(zhì)的分子量；4）吸附性質(zhì).主要有離子交換層析：又稱凝膠過濾法、電泳法分離蛋白質(zhì)混合物的各種方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的以下性質(zhì)，分布于不同的液層而分離.常見的分離提純蛋白質(zhì)的方法有：蛋白質(zhì)分子在高于或低于其pI的溶液中帶凈的負(fù)或正電荷.3：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽：利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異：利用透析袋膜的超濾性質(zhì)：1，因此在電場中可以移動.6.凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進(jìn)行分離.2、氯化鈉、超速離心.5，大分子蛋白質(zhì)不能進(jìn)入孔內(nèi)而徑直流出、甲醇，均可引起蛋白質(zhì)沉淀.常用的中性鹽有，因此不同大小的蛋白質(zhì)得以分離，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)，因而在柱中滯留時間較長：硫酸銨，經(jīng)超速離心后，凝膠層析、鹽析與有機(jī)溶劑沉淀：1）分子大小.超速離心也可用來測定蛋白質(zhì)的分子量，溶液的pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，稱為鹽析、分子篩，如乙醇；3）電荷；2）溶解度，蛋白質(zhì)溶液加于柱之頂部.4、硫酸鈉等，吸附層析及親和層析等，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出、層析法，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比、透析法.鹽析時.電泳遷移率的大小主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷量以及分子大小、丙酮等；5）對其它分子的生物學(xué)親和力等進(jìn)行分離：利用物質(zhì)密度的不同，可將大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分離開，任其往下滲漏。

3.蛋白質(zhì)的分離方法有哪些

1.根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化 蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì)，并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開，并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。

根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時常用的方法。

透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液進(jìn)行分離。超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程。

這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機(jī)鹽為主的小分子分開。它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無機(jī)鹽。

由于超濾過程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，以致超濾速度減慢，截流物質(zhì)的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜，也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果 離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如，在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實驗中，加入纖維素酶和α-淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后，再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離[3]。

使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度（區(qū)帶）離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。

可以根據(jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白，得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。

蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果，利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。

凝膠過濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時，比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動并最先流出柱外；反之，比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。

在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果，純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)（88∶12）、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7]。

2.根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下，不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度，根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件，就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。

常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。 等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法。

每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn)，而且在等電點(diǎn)時溶解度最低；相反，有些蛋白質(zhì)在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質(zhì)。

王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過程發(fā)現(xiàn)，pH值為時茶葉蛋白提取效果最好，提取率達(dá)到36·8%，初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4，使目標(biāo)蛋白于等電點(diǎn)沉淀出來。

等電點(diǎn)沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為3·8。

他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì)，得到了最佳的提取工藝為：以1*10-5mol·L-1的NaOH溶液，按1∶5的料液比，在40℃攪拌40 min，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達(dá)73·78%。另外還可以利用堿法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11]。

利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質(zhì)無腥味、色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)90%[12]。 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象，其中，增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶，反之為鹽析。

應(yīng)當(dāng)指出，同樣濃度的二價離子中性鹽，如MgCl2、（NH4）2SO4對蛋白質(zhì)溶解度影響的效果，要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質(zhì)，其最佳提取工藝是：以10%NaCl溶液，按1∶25的料液比，在30℃攪拌提取30min，蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10]。

鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法，其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性，為防止其對蛋白質(zhì)的破壞，應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性。

為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后，通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。

有機(jī)溶劑提取法的原理是：與水互溶的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇）能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此，控制有機(jī)溶劑的。

4.蛋白質(zhì)分離方法有哪些

據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。

透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時常用的方法。

透析是將待分離的混合物放入半透膜知制成的透析袋中，再浸道入透析液進(jìn)行分離。超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程。

這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機(jī)回鹽為主的小分子分開。

它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無機(jī)鹽。

由于超濾過程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，以致超濾速度減慢，截流物質(zhì)的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜，也可以選擇切向流過濾得到更理答想的效果。

5.蛋白質(zhì)分離純化常用的方法

1、沉淀

2、電泳：蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點(diǎn)的溶液中是帶電的，在電場中能向電場的正極或負(fù)極移動。根據(jù)支撐物不同，有薄膜電泳、凝膠電泳等。

3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。

4、層析： a.離子交換層析，利用蛋白質(zhì)的兩性游離性質(zhì)，在某一特定PH時，各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同，故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析，含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。 b.分子篩，又稱凝膠過濾。小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)，滯留時間長，大分子蛋白質(zhì)不能同時入孔內(nèi)而徑直流出。

5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量。不同蛋白質(zhì)其密度與形態(tài)各不相同而分開。

6.蛋白質(zhì)分離鑒定的常用方法有哪些

蛋白質(zhì)分離鑒定的常用方法：? 沉淀法 沉淀法也稱溶解度法。

其純化生命大分子物質(zhì)的基本原理是根據(jù)各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異性來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致有效成分的溶解度發(fā)生變化。 1、鹽析法 鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出。

2、有機(jī)溶劑沉淀法 有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。 3、蛋白質(zhì)沉淀劑 蛋白質(zhì)沉淀劑僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉淀作用 聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。 5、選擇性沉淀法 根據(jù)各種蛋白質(zhì)在不同物理化學(xué)因子作用下穩(wěn)定性不同的特點(diǎn)，用適當(dāng)?shù)倪x擇性沉淀法，即可使雜蛋白變性沉淀，而欲分離的有效成分則存在于溶液中，從而達(dá)到純化有效成分的目的。

吸附層析 1、吸附柱層析 吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機(jī)溶劑或緩沖液為流動相構(gòu)成柱的一種層析方法。 2、薄層層析 薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。

這種層析方法是把吸附劑等物質(zhì)涂布于載體上形成薄層，然后按紙層析操作進(jìn)行展層。 3、聚酰胺薄膜層析 聚酰胺對極性物質(zhì)的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。

這種氫鍵的強(qiáng)弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。

因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤觿┦狗蛛x在聚酰胺膜表面發(fā)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續(xù)過程，就能導(dǎo)致分離物質(zhì)達(dá)到分離目的。 離子交換層析 離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。

離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。

凝膠過濾 凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部。當(dāng)一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開了。

親和層析 親和層析的原理與眾所周知的抗原-抗體、激素-受體和酶-底物等特異性反應(yīng)的機(jī)理相類似，每對反應(yīng)物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應(yīng)中，特異的底物（S）才能和一定的酶（E）結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物（E-S）一樣。

在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。而親和層析與酶-底物反應(yīng)不同的是，前者進(jìn)行反應(yīng)時，配體（類似底物）是固相存在；后者進(jìn)行反應(yīng)時，底物呈液相存在。

實質(zhì)上親和層析是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M（如活化瓊脂糖等）上，制成親和吸附劑M-L，或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。

因此，當(dāng)把固相載體裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）后，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質(zhì)S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質(zhì)則被起始緩沖液洗滌出來，并形成了第一個層析峰。

然后，恰當(dāng)?shù)馗淖兤鹗季彌_液的pH值、或增加離子強(qiáng)度、或加入抑制劑等因子，即可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來，并形成了第M個層析峰。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質(zhì)滿意地分離開。

如果樣品液中存在兩個以上的物質(zhì)與固相載體具有親和力（其大小有差異）時，采用選擇性緩沖液進(jìn)行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經(jīng)再生處理后，可以重復(fù)使用。

上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。

這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強(qiáng)的吸附選擇性和較大的結(jié)合力。而后者的配體則一般為簡單的小分子物質(zhì)（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率。

聚焦層析 聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。

聚焦層析原理可以從pH梯度溶液的形成、蛋白質(zhì)的行為和聚焦效應(yīng)三方面來闡述。 1、PH梯度溶液的形成 在離子交換層析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現(xiàn)的。

例如，當(dāng)使用陰離子交換劑進(jìn)行層析時，制備pH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室中裝高pH溶液，而在另一室裝低pH極限溶液，然后打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續(xù)不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的。

7.請簡述可用于蛋白質(zhì)分離純化的四種方法及其原理

樓主，方法很多，我就挑幾個比較有代表的吧

1.親和層析：利用分子與其配體間特殊的、可逆性的親和結(jié)合作用而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。

原理：將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開，然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘海?改變結(jié)合條件將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來。

3.聚丙烯酰胺凝膠電泳：用于分離蛋白質(zhì)和寡糖核苷酸。

作用原理 聚丙烯酰胺凝膠電泳是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式：（1）非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。

/view/320392.htm

4.鹽析：增加中性鹽濃度使蛋白質(zhì)、氣體、未帶電分子溶解度降低的現(xiàn)象。是蛋白質(zhì)分離純化中經(jīng)常使用的方法，最常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等。

/view/210139.htm